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SUN1/2对斑马鱼集中延伸运动的调节及其机制的研究

作 者: 杨阳
导 师: 郝爱军; 马保华
学 校: 山东大学
专 业: 人体解剖与组织胚胎学
关键词: 集中延伸运动?Sun1?Sun2?β-catenin?Wnt/PCP信号通路
分类号: Q51
类 型: 硕士论文
年 份: 2013年
下 载: 8次
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内容摘要


SUN结构域蛋白(SAD1/UNC84domain containing protein)是一类C端含有保守SUN结构域的蛋白,该结构域与酿酒酵母中的SAD1蛋白和线虫中UNC-84蛋白有很高的同源性。目前,在哺乳动物中已发现的SUN结构域蛋白至少有四个,包括SUN1、SUN2、SUN3和SPAG4。其中SUN1和SUN2在哺乳动物各组织中广泛表达,SUN3和SPAG4表达较少。在结构上,哺乳动物中SUN1和SUN2蛋白的N端均定位于细胞核内,与核纤层蛋白相互连接,而其包含SUN结构功能域的C端则定位于双层核膜之间,通过Nesprin蛋白与细胞骨架相连。SUN1/2蛋白通过这种结构形成LINC (linker of nucleoskeleton and cytoskeleton)复合体,直接与细胞骨架和核骨架相连接,因此SUN1/2蛋白被认为在细胞核定位和迁移上具有非常重要的作用。研究表明,Sun1/2双敲小鼠(Sun1-/-; Sun2-/-)在胚胎发育早期死亡,提示SUN1/2蛋白可能在早期胚胎发育中起到极其重要的作用。虽然SUN1/2蛋白在核定位和迁移中的功能已经有所报道,但是其在胚胎早期发育特别是原肠运动中的作用还没有相关研究。原肠运动是斑马鱼早期胚胎发育过程中三胚层形成的重要过程,其中集中延伸运动是其最主要的程序,它对于斑马鱼体轴的形成和延长起关键作用。在脊椎动物中,集中延伸运动主要受到平面细胞极性途径(Wnt/Planar Cell Polarity pathway, Wnt/PCP)的调节,它对于细胞的迁移以及胚胎发育过程中细胞的内卷内嵌等过程都起到显着的调节作用。本课题通过在斑马鱼胚胎1-4细胞期注射吗啉反义寡聚核苷酸(Morpholino, MO),特异性抑制SUN1和SUN2蛋白的表达,研究其在斑马鱼早期胚胎发育中的作用及相关机制。第一部分Sun1/2基因在斑马鱼早期胚胎中的表达为探讨SUN1/2蛋白在斑马鱼早期胚胎发育中的功能,我们首先采用胚胎整封原位杂交和RT-PCR的方法,检测了Sun1/2基因在斑马鱼发育早期的时空表达情况。原位杂交结果显示,Sun1和Sun2基因在胚胎8细胞期已经表达,为母源性表达,且在斑马鱼胚胎呈现泛表达;RT-PCR结果显示,Sunl在斑马鱼胚胎30%下包期表达较高,而Sun2在胚胎30%下包至尾芽期均呈现高表达。以上结果提示,SUN1/2可能在斑马鱼早期胚胎发育原肠运动中起到重要作用。第二部分SUN1/2对斑马鱼早期胚胎发育集中延伸运动的影响为研究SUN1/2蛋白在斑马鱼胚胎发育中的作用,我们采用胚胎早期显微注射MO的方法,特异性抑制SUN1/2蛋白的表达,并观察对于胚胎发育的影响。结果发现,单独抑制SUN1或SUN2的表达,没有对胚胎发育产生严重影响,而同时抑制SUN1/2的表达,胚胎表现出前后体轴缩短、尾部弯曲、体节部位变宽等表型,且呈现出一定程度的MO剂量依赖性。由此提示SUN1/2蛋白存在功能上的冗余,而同时抑制SUN1/2蛋白的表达对斑马鱼胚胎早期发育中的原肠运动造成影响。为进一步确认抑制SUN1/2蛋白的表达是否对斑马鱼胚胎原肠运动中极其重要的集中延伸运动造成影响,我们采用胚胎整封原位杂交技术,检测了集中延伸运动相关标记基因ntl、hggl、dlx3b、tbx6、myodl、 krox20等的表达变化。结果显示,抑制SUN1/2蛋白表达后,胚胎集中延伸相关标记基因表达均出现明显异常或异位,表明抑制SUN1/2表达后,胚胎发育中的轴向中胚层、轴旁中胚层、神经外胚层发育均出现缺陷,胚胎集中延伸运动受到严重影响。由此可见,SUN1/2蛋白在斑马鱼胚胎早期发育的集中延伸运动过程中发挥着重要的作用。第三部分SUN1/2对斑马鱼集中延伸运动调节机制的研究哺乳动物中的研究证实,SUN1/2蛋白对于核孔复合体在核膜上正常分布很重要,而脊椎动物原肠运动中的细胞迁移与β-catenin蛋白在细胞内的分布相关。为研究SUN1/2蛋白是否通过影响β-catenin蛋白的核转运调节斑马鱼集中延伸运动,我们收集注射MO的斑马鱼胚胎,分离核蛋白及胞浆蛋白,采用蛋白免疫印迹技术检测β-catenin蛋白在细胞核及细胞浆中的分布变化。结果显示,注射SUN1/2MO并未影响P-catenin蛋白在细胞内的分布,提示抑制SUN1/2蛋白的表达并未影响核孔复合体的核转运功能。此外,脊椎动物中,集中延伸运动主要受到Wnt/PCP信号通路的调节。为研究抑制SUN1/2表达后是否影响Wnt/PCP信号通路,我们采用蛋白免疫印迹技术,检测了关键因子P-JNK蛋白表达情况,结果发现抑制SUN1/2蛋白表达后,P-JNK表达明显降低。为进一步验证该结果,我们采用RT-PCR技术检测了Wnt/PCP信号通路下游靶基因livl和stat3的表达情况,结果显示抑制SUN1/2表达后,liv]和stat3表达有所下调。这些结果表明,SUN1/2通过Wnt/PCP信号通路调节斑马鱼集中延伸运动,对于进一步深入的调节机制有待于继续研究。总之,通过本研究我们发现,SUN1/2蛋白通过Wnt/PCP信号通路对斑马鱼的原肠运动中的集中延伸运动起重要的调节作用。这些研究结果揭示了SUN1/2蛋白在斑马鱼早期胚胎发育中的重要作用。

全文目录


中文摘要??6-9
ABSTRACT??9-12
符号说明??12-14
前言??14-16
第一部分 Sun1/2在斑马鱼早期胚胎中的表达??16-29
??材料和方法??16-24
??结果??24-25
??讨论??25-26
??结论??26-27
??附图??27-29
第二部分 SUN1/2对斑马鱼早期胚胎发育集中延伸运动的影响??29-43
??材料和方法??29-36
??结果??36-38
??讨论??38-39
??结论??39-40
??附图??40-43
第三部分 SUN1/2对斑马鱼集中延伸运动调节机制的研究??43-50
??材料和方法??43-44
??结果??44-45
??讨论??45-46
??结论??46-47
??附表??47-48
??附图??48-50
参考文献??50-53
致谢??53-54
攻读学位期间发表的学术论文目录??54-55
学位论文评阅及答辩情况表??55

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中图分类: > 生物科学 > 生物化学 > 蛋白质
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